Cyténetique moleculaire
(cytogenetique )

Chapitre1 : Rappel des notions de cytogénétique

I. Les chromosomes

1. Structure des chromosomes

Les chromosomes sont constitués d'ADN associée à de nombreuses protéines ; ils servent de support à l'information génétique. Le nombre de chromosomes par cellule est une caractéristique d'espèce ; dans l'espèce humaine, il y a 46 chromosomes (23 paires) se présentant en 22 paires de chromosomes identiques (homologues), les autosomes et une paire de chromosomes sexuels ou gonosomes , sauf dans les cellules reproductrices ou gamètes ou ils sont au nombre de 23 chromosomes (haploïde n).

 Les chromosomes ne sont visibles que pendant une courte période du cycle cellulaire. En effet, ils représentent la forme la plus condensée que peut prendre une molécule d'ADN. Cette condensation extrême, si elle empêche toute transcription des gènes, permet une ségrégation correcte des molécules entre les deux cellules filles au cours des divisions cellulaires. Entre chaque division, les molécules d'ADN se décondensent et ne sont plus visibles individuellement : elles constituent dans leur ensemble la chromatine du noyau interphasique. Au moment d'une division cellulaire (aussi bien mitose que méiose), après s'être dupliquée, chaque molécule d'ADN se condense et devient visible au microscope sous la forme d'un chromosome.

Chaque chromosome est constitué de bras, de centromère et de télomères.

 

1.1. Les bras du chromosome: sont les deux segments du chromosome séparés par une zone étranglée appelée centromère. Ils ont une taille variable en fonction des chromosomes, mais on reconnaît toujours un bras court noter " p " et un bras long noté " q ". Chaque extrémité des chromosomes prend le nom de télomère (deux télomères par chromosome). Chacun des bras est constitué de deux chromatides. Ces deux chromatides correspondent aux deux molécules identiques qui résultent de la réplication de l'ADN. 

 

1.2.Le centromère : est la région sur laquelle s'attachent les microtubules du fuseau de division, au niveau d'une zone particulière appelée kinétochore. Le kinétochore est un complexe protéique qui s'assemble sur les deux faces du centromère et qui sert de lien entre les microtubules du fuseau et le chromosome.

C'est la dernière région chromosomique à se scinder en deux au moment de l'anaphase. Sur le plan moléculaire, le centromère est composé dʼhétérochromatine constitutive, et de séquences d'ADN répétées en tandem un grand nombre de fois sans rôle de transcription connu.

Selon la position du centromère, il existe 3 types de chromosomes (Fig.1) :

- Les chromosomes métacentriques : le bras p et q ont la même longueur.

- Les chromosomes submétacentriques : le bras p est nettement plus court que le bras q.

- Les chromosomes acrocentriques : le bras p est très petit.

 

Figure 1 : a : chromosome métaphasique, b : les différents types de chromosomes. (Huret JL, et al 2013)

Lors de la réalisation du caryotype, les chromosomes sont répartis en 7 groupes en fonction de leur morphologie (Fig.2) :

- groupe A (1, 2, 3) métacentriques grands

- groupe B (4, 5) submétacentriques grands

- groupe C (6 à 12 + X) moyens submétacentrique

- groupe D (13, 14, 15) acrocentriques moyens/petits

- groupe E (16,17, 18) submétacentriques petits

- groupe F (19,20) métacentriques petits

- groupe G (21, 22 + Y) acrocentriques petits, Y n’est pas appelé acrocentrique

 

Les chromosomes acrocentriques sont réparties entre les groupes D et G (que 21 et 22)

 

 

Figure 2 : Caryotype schématisé (Huret JL, et al 2013)

 

 

1.3. Le télomère : est le segment terminal des bras chromosomiques. Les télomères sont constitués par des répétitions en tandem d'un motif de 6 paires de bases. La taille des télomères varie non seulement d'une espèce à une autre, d’un individu à un autre, et aussi d’un chromosome à un autre chez un même individu. Le nombre de répétitions diminue avec l'âge. Il a un rôle fondamental de stabilisation et de protection des extrémités chromosomiques de la dégradation, de la recombinaison et de la fusion à d'autres chromosomes. D’autre part, il assure la réplication de la partie extrême du chromosome.

 

1.4. Satellite et pédoncule du chromosome :  Le satellite du chromosome est un segment chromosomique séparé de la partie principale du chromosome par la construction nucléolaire secondaire. L'ensemble du satellite et de la construction nucléolaire secondaire est appelé la région satellite.

 

1.5. Marque du chromosome : on appele marque du chromosome les structures stables et importantes qui peuvent être utilisées pour identifier les différentes régions du chromosome individuel, inclut : les centromères, les télomères, les bandes évidentes.

 

 

2. le caryotype et ces étapes de réalisation:

Le caryotype permet l’étude des chromosomes d’un individu. C’est la présentation de façon ordonnée des chromosomes d’une cellule en fonction de la taille. Un caryotype humain comporte 46 chromosomes qui se répartissent en 22 paires de chromosomes autosomiques et une paire de chromosome sexuel XX ou XY. Il contribue à la mise en évidence des remaniements chromosomiques par l’analyse numérique et structurale.

On peut faire un caryotype à partir de plusieurs types de cellules nucléés qui ont la capacité de se multiplier facilement tel que: les fibroblastes, les cellules amniotiques, les cellules de la moelle osseuse et les lymphocytes.

 

La réalisation du caryotype passe par les étapes suivantes :

  2.1. Culture cellulaire : Pour cela, il est nécessaire d'avoir des cellules en phase de multiplication active, soit spontanément (cas des villosités choriales ou de certaines cellules tumorales) soit par une culture préalable le plus souvent (fibroblastes, tout type cellulaire capable de se diviser) parfois associée à une stimulation (lymphocytes sanguins). La durée de cette culture est variable en fonction du type cellulaire considéré et de la quantité de matériel biologique disponible au départ.

   2.2. Blocage des cellules en mitose : qui consiste à bloquer les cellules en métaphase afin de pouvoir observer les chromosomes. Pour cela, on utilise un poison du fuseau de division (classiquement c'est la Colchicine qui est utilisée ou son équivalent synthétique la Colcémide) qui empêche la progression de la mitose vers l’anaphase.

   2.3. Choc hypotonique : Les cellules sont alors plongées dans une solution hypotonique ce qui entraîne leur gonflement. Cette étape est indispensable à l'obtention d'un étalement correct des chromosomes.

   2.4. Fixation Etalement : Enfin, la dernière étape consiste en une fixation par un mélange d'alcool et d'acide acétique. La préparation est alors étalée en laissant tomber une goutte de la suspension cellulaire sur une lame.

   2.5. Coloration des préparations : Lorsque l'on colore des préparations chromosomiques avec du Giemsa, les chromosomes prennent un aspect rose violacé à peu près homogène sur toute leur longueur. On ne peut donc les distinguer les uns des autres que par leur taille et leur forme. Cependant, ces critères sont insuffisants pour assurer la reconnaissance et l'interprétation correcte des anomalies chromosomiques. Pour reconnaître spécifiquement chaque paire chromosomique, on utilise donc des techniques de marquage particulières qui permettent d'obtenir une coloration inhomogène des chromosomes par le Giemsa et l'apparition de bandes.

C'est la succession de bandes sombres et claires le long d'un chromosome, identique chez tous les individus pour un chromosome donné, qui en permet l'identification précise, selon le même principe qu'un code à barres.

  2.6. Techniques de bandes :

  • Technique de bandes Q : Cette méthode nécessite une coloration par la moutarde de Quinacrine ou ses dérives. Lors de l’examen au microscope en fluorescence, cette coloration fait apparaître une succession caractéristique de bandes sombres et brillantes (bandes Q).
  • Technique de bandes G : Cette technique sont traités à l’aide de la trypsine pour dénaturer les protéines chromosomiques et sont ensuite colorés au moyen du Giems. Chaque paire chromosome homologue possède une distribution caractéristique de bandes claires et sombres (bandes G).
  • Technique de bandes R : Lorsque les chromosomes sont prétraités par la chaleur avant la coloration au Giemsa, les bandes sombres et claires obtenues (bandes R) ont une distribution inverse de celle produite par les techniques de bandes G ou de bandes Q.
  • Technique de bandes C : Les chromosomes sont prétraités par l’acide dilué et suivi de l’alcali fort et de la saline douce, puis coloré au moyen de Giemsa. Cette méthode colore de façon spécifique les régions centromériques de chaque chromosome et d’autres régions contenant également l’hétérochromatine : notamment les régions des chromosomes 1q, 9q et 16q adjacentes au centromère ainsi que la partie distale du bras long du chromosome Y(Yq).
  • NOR : cette technique consiste en un dépôt de nitrate d'argent qui met en évidence les organisateurs nucléolaires. Ces structures correspondent aux régions du génome contenant les gènes qui codent pour les ribosomes qui participent à la formation et au maintien des nucléoles dans le noyau interphasique. Ils sont situés sur les bras court des chromosomes 13, 14, 15, 21 et 22.
  • Technique de bandes en haute résolution : c’est une analyse fine du caryotype par l’étude, après coloration en bandes G ou R, des cellules en prophase tardive ou en métaphase précoce qui sont obtenues par synchronisation de la culture cellulaire. Les deux agents utilisés les plus fréquemment sont l’améthopterine et la thymidine. Le traitement de colchicine est réduit à15 minutes environ. Ce qui permet le passage d’un système de 300 bandes à un système de plus de 1000 bandes par lot haploïde. Le chromosome est moins condensé qu’en métaphase donc on peut détecter des anomalies qui n’apparaissent pas sur un caryotype classique(les microdélétions).

Afin d’effectuer la lecture du caryotype, on prend une photo d’une mitose ou les chromosomes sont bien individualisés. Après agrandissement, on découpe les chromosomes et on les classe enfin selon la nomenclature internationale. Actuellement, il existe des logiciels qui permettent le classement sur ordinateur.

3. Lecture et interprétation du caryotype :

Il existe une nomenclature internationale (ISCN : International System for human Cytogenetic Nomenclature) permettant de définir précisément la constitution chromosomique d'un sujet. La règle de lecture du caryotype fait appel :

 

  3.1. Aux annotations en usage en cytogénétique : Le nombre de chromosomes : 46 n. La lettre désignant les chromosomes sexuels : homme XY ; femme XX. Le caryotype normal :

  • homme 46, XY
  • femme 46, XX

       s’il y a un chromosome anormal, celui-ci est désigné par son numéro (1 à 22) ou par son groupe (A à G), ou par sa lettre (X ou Y), suivi d’un signe + ou - s’il y a respectivement une augmentation ou une perte de substance.

 

Ces annotations aboutissent à la formule chromosomique qui se déchiffre de la façon suivante : "Nombre de chromosomes par cellule", "Liste des chromosomes sexuels présents", "Liste des anomalies trouvées".

Toutes les anomalies chromosomiques sont identifiées par une abréviation, permettant de les décrire dans la formule chromosomique ; les points de cassure sont également indiqués quand ils peuvent être identifiés.

 

Exemples :

- caryotype masculin normal : 46,XY c'est-à-dire 46 chromosomes par cellule, dont un chromosome X et un chromosome Y

- caryotype féminin normal : 46,XX, c'est-à-dire 46 chromosomes par cellule, dont deux chromosomes X

- trisomie 21 : 47,XY,+21 c'est-à-dire 47 chromosomes par cellule, dont un chromosome X et un chromosome Y, + un chromosome 21 surnuméraire

- syndrome de Turner : 45,X c'est-à-dire 45 chromosomes par cellule, avec un seul gonosome qui est un chromosome X

- translocation : 46,XX,t(1;18) c'est-à-dire 46 chromosomes par cellule, dont deux chromosomes X et une translocation entre un chromosome 1 et un chromosome 18.

 

   3.2. Aux coordonnées cytogénétiques

Ce sont des indications chiffrées ou alphabétiques qui permettent d’identifier avec précision une partie, une portion ou un point d’un chromosome. Ces coordonnées permettent ainsi de distinguer exactement chaque paire de chromosomes (1à 22 plus le X et le Y) et sur chaque chromosome des portions bien délimitées avec les notions de région, de bandes, de sous bandes voire de sous sous bandes.

  • Les régions : Elles constituent le 1er niveau de subdivision des bras p et q des chromosomes. Dans l’International System for human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) 95, le nombre de régions sur chaque bras et pour chaque chromosome a été défini. Il varie de 1 à 4 ; plus le chromosome est grand, plus il possède de régions. Ainsi le chromosome 1 a 3 régions sur le p et 4 régions sur le q.

Le Y n’a qu’une seule région et c’est le bras q. Les numéros des régions sont exprimés de 1 à ... en partant du centromère.

Exemples :

-          1p2, lire : deuxième région du bras court du chromosome 1.

-          4p1, lire : première région du bras court du chromosome 4.

-          22q1, lire : première région du bras long du chromosome 22.

 

  •  Les bandes : Elles représentent les successions de zones foncées et claires qui apparaissent après les techniques classiques de marquage ou banding G, R. Le nombre de bandes par région varie de 2 à 6.

Exemples :

      -  1p32 : deuxième bande de la troisième région du bras court du chromosome 1

      -   22q11 : première bande de la première région du bras long du chromosome 22

La numérotation se fait du centromère vers le télomère. Il n’y a pas de point (.) entre la région et la bande.

 

  • Les sous bandes : Compte tenu du niveau d’étirement ou d’élongation des chromosomes, on peut avoir une subdivision des bandes, ce qui donne des sous bandes. En général, il en existe deux ou trois (proximal, médian ou distal). Pour l’annotation à ce niveau, on sépare les sous bandes des bandes par un point (.).

Exemples :

-          1p36.3 : troisième sous bande de la sixième bande de la troisième région du bras court du chromosome1

-          4p16.1 : première sous bande de la sixième bande de la première région du bras court du chromosome 4

-          13q14.2 : deuxième sous bande de la quatrième bande de la première région du bras long du chromosome 13

Signalons qu’une sous bande peut également être subdivisée en sous sous bande. La numérotation se faisant toujours du centromère vers le télomère.

En conclusion, pour désigner un point d’un chromosome, il faut quatre données :

  le numéro du chromosome
  le symbole du bras concerné : court (p) ou (long) q
  le numéro de la région (1 à 4)
  le numéro de la bande (1 à 6)

  • Exemples :

-          22q11 : 1ère bande de la 1ère région du bras long du chromosome 22 (le syndrome de Di George)

-          5p15 : cinquième bande de la première région du bras court du chromosome 5 (La maladie du cri du chat)

II. Anomalies de nombre et de structure

 On appelle anomalie chromosomique tout remaniement du nombre ou de la structure des chromosomes. Ces remaniements peuvent s'observer de manière constitutionnelle (présents dès la naissance) soit de manière acquise au cours de processus malins (cellules tumorales). Ils résultent d'un accident survenant soit au cours de la méiose, soit au cours d'une mitose. Ils peuvent impliquer un ou plusieurs chromosomes. On reconnaît par ailleurs les anomalies dites homogènes (quand toutes les cellules examinées portent l'anomalie) et les anomalies en mosaïque (quand une fraction seulement des cellules est anormale).

Leurs conséquences sont variables en fonction du remaniement considéré.

-       Les remaniements dits équilibrés : c'est-à-dire sans perte ni gain de matériel génétique, n'ont habituellement pas de conséquence pour le sujet porteur,

-       Les remaniements déséquilibrés : se traduisent par des manifestations cliniques d'autant plus graves que la perte ou le gain de matériel est plus important.

1. Les anomalies de nombre :

Les plus fréquentes sont les aneuploïdies : c’est à dire la perte ou le gain d’un ou quelques chromosomes. Les polyploïdies désignent un nombre anormal de lots haploïdes entiers.

   

 1.1. Trisomies

Une trisomie correspond à la présence d’un chromosome supplémentaire. Le nombre de chromosomes est donc de 47 et non plus de 46. Tous les chromosomes peuvent être impliqués, mais seulement trois trisomies autosomiques sont viables à l’état homogène dans l’espèce humaine :

-           Trisomie 21 (Syndrome de Down)

-           Trisomie 13 (Syndrome de Patau)

-           Trisomie 18 (Syndrome d'Edwards)

D’autres trisomies peuvent être observées en mosaïque, pour le 8 ou le 9 par exemple. Le gain d’un chromosome peut également concerner les gonosomes :

-           Trisomie X (Syndrome Triple X) :

-           Le syndrome de Klinefelter : L'individu possède deux chromosomes X et un chromosome Y (XXY).

-           Le Syndrome de Jacob : l'individu possède un chromosome Y en double exemplaire, et un chromosome X (XYY)

Le nombre de chromosomes surnuméraires peut être supérieur. Des trisomies multiples peuvent également être observées.

Figure 3 : Trisomie 21(Huret JL, et al 2013)

 

   1.2. Monosomies 

Une monosomie correspond à la perte d’un chromosome. Le nombre de chromosome est donc de 45. Aucune monosomie autosomique constitutionnelle n’est viable (élimination dès les premiers stades de la vie embryonnaire). Pour ce qui concerne les chromosomes sexuels, la monosomie X est responsable du syndrome de Turner, il s’agit de la seule monosomie homogène viable dans l’espèce humaine.

Figure 4 : Syndrome de turner (Huret JL, et al 2013)

 

1.3. Polyploïdies

Elles correspondent à un nombre anormal de lots haploïdes entiers. Normalement chaque individu est constitué d’un lot haploïde maternel (n) et d’un lot haploïde paternel (n) soit 2n. Chez l’homme ont été décrit des :

-           triploïdie (3n) : 69 chromosomes

-           tétraploïdie (4n) : 92 chromosomes

Concernant les triploïdies on distingue les triploïdies avec deux lots haploïdes d’origine maternelle des triploïdies avec deux lots haploïdes d’origine paternelle. Les polyploïdies homogènes sont habituellement létales, mais peuvent être viables en mosaïque.

 

1.4. Mosaïques 

Les anomalies de nombre peuvent être homogènes, présentes dans toutes les cellules de l’organisme, ou en mosaïque. Une mosaïque se défini par la coexistence chez un même individu d’au moins deux populations cellulaire (clones) de composition génomique différente issues du même zygote. Les mosaïques résultent d’accidents post zygotiques.

Exceptionnellement, il peut coexister chez un même individu deux populations cellulaires issues de deux zygotes différents. On parle alors de chimère. Elles sont dues à des accidents de la fécondation proprement dite, tels que la double fécondation.      

 

2. Les anomalies de structure :

Elles sont la conséquence d'un réarrangement du matériel chromosomique. Ces réarrangements peuvent concerner un seul chromosome ou plusieurs.

 

2.1. Anomalies de structure touchant un seul chromosome.  

  a. Inversions (inv): Les inversions sont dues à deux cassures sur le même chromosome, suivies de recollement après inversion du segment intermédiaire. Et on trouve deux types d’inversion :

-       Inversion péricentrique : le centromère est compris dans le segment intermédiaire (Fig. 5).

Figure 5 : Mécanisme de formation d’une inversion péricentrique. (De Grouchy J, Turleau C. 1982)

-Inversion paracentrique: les deux cassures se sont produites sur le même bras chromosomique (Fig. 6 ).  

Figure 6 : Mécanisme de formation d’une inversion paracentrique (De Grouchy J, Turleau C. 1982)

b. Délétion : perte d'un fragment de chromosome. La délétion est dite interstitielle quand il y a perte d'un fragment intermédiaire (deux points de cassure comme dans l'inversion), et dite terminale quand l'extrémité d'un bras chromosomique est concernée (un seul point de cassure)(fig. 7).

Figure 7 : les types de deletion (De Grouchy J, Turleau C. 1982)

c. Duplication : c’est la présence en double exemplaire d'une région chromosomique. La duplication est dite directe si le fragment dupliqué conserve la même orientation que le fragment d'origine, et inversée si le fragment dupliqué a une orientation inverse. (fig. 8).

Figure 8 : Processuce de duplication (De Grouchy J, Turleau C. 1982)

d. Chromosome en Anneau : comme son nom l'indique, il s'agit d'un chromosome de forme circulaire. Une telle image résulte d'une cassure sur chacun des deux bras du chromosome, suivie d'une fusion des extrémités libres du bras court et du bras long ; les deux fragments distaux sont perdus. (fig. 9)

Figure 9 : Mécanisme de formation d’un anneau chromosomique (De Grouchy J, Turleau C. 1982)

e. Isochromosome : c’est un chromosome anormal formé de deux bras longs ou de deux bras courts d'un même chromosome avec perte de l’autre bras. Un isochromosome peut être monocentrique ou dicentrique selon le mécanisme de formation.  (fig. 10).

Figure 10  : Mécanisme de formation d’un isochromosome. (Huret JL, et al 2013)

 

2.2. Anomalies de structure touchant plusieurs chromosomes.  

      a.Translocation réciproque : il s'agit d'un échange de matériel entre deux chromosomes non homologues après cassure sur chacun des chromosomes impliqués. Si cet échange s'accompagne d'une perte de matériel génétique, il est déséquilibré, sinon la translocation est dite équilibrée. Dans certains cas exceptionnels, une translocation réciproque peut impliquer trois voire quatre chromosomes différents.(fig. 11).

Figure 11: Formation de la translocation réciproque (De Grouchy J, Turleau C. 1982)

    b.Translocation robertsonienne : cas particulier de translocation impliquant deux chromosomes acrocentriques (chromosomes 13, 14, 15, 21 et 22) dont le bras court de très petite taille et ne code que pour des gènes répétés. La translocation consiste en une fusion des chromosomes avec perte des bras courts, sans aucune conséquence clinique directe pour le sujet porteur. (fig. 12)

Figure 12 : Formation d’une translocation robertsonienne (De Grouchy J, Turleau C. 1982)

  c. Insertion : autre cas particulier de translocation ou un fragment de chromosome est inséré au sein d'un autre. Cette anomalie nécessite trois points de cassure (Fig. 13)

Figure 13 : mécanisme d’insertion (De Grouchy J, Turleau C. 1982)